生物3D打印作为一种新型研究技术手段在组织及再生医学领域内被广泛研究,已成为近些年国内外的研究热点。该文总结了生物3D打印的发展历程,并对其在颅颌面损伤修复中的国内外研究进展和应用进行了综述,同时结合团队自身研究展开了一些思考。

随着技术和材料的不断发展,生物3D打印技术在医学领域中的应用从制造无生命的模型、纯材料支架跨越到有生命的细胞、组织甚至器官的仿生构建,使其在临床及再生医学领域中的应用具有巨大潜力。本文结合近年来国内外生物3D打印在颅颌面损伤修复中的研究进展及应用进行综述,也结合团队自身的研究展开一些思考,探讨其未来发展趋势。

一、 生物3D打印技术的起源及定义

2011年,英国《经济学人》杂志将3D打印技术视为“第三次工业革命”的重大标志之一,其概念最早可追溯到1976年美国惠普公司发明喷墨打印技术,但首次实践是1984年由美国3D Systems公司的联合创始人Charles Hull进行的,其发明了液态光固化3D打印技术,使用光敏树脂材料作为打印墨水,逐层累积,形成固态的3D结构[1]。1988年,美国Scott Crump发明了熔融沉积成型3D打印技术。1989年,美国C.R. Dechard发明了选择性激光烧结技术。直到1992年美国麻省理工学院申请了首个以“3D打印”为名称的专利,后授权多个公司进行商业开发,至此3D打印技术得以迅速推广和发展。1999年,Odde和Renn[2]第1次利用激光来辅助沉积活细胞,通过光的强度控制细胞排列成具有高精度的空间结构。
细胞及器官打印的概念是美国Clemson大学Thomas Boland教授于2000年左右提出的,2003年Mironov等[3]在著名国际生物杂志Trend in Biotechnology上发表“Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering”(器官打印:计算机辅助的、基于喷墨的3D组织工程技术)一文,第1次全面系统地阐述了“器官打印”这一革命性概念。2004年,美国密苏里大学Jakab等[4]在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(PNAS)上发表“Engineering biological structures of prescribed shape using self-assembling multicellular systems”(利用自组装的多细胞系统制造规定形状的生物结构),进一步强化了细胞打印技术的概念。
现代意义的生物3D打印主要是指以细胞或细胞团、生物活性因子、生物材料等作为原材料,用3D打印的方式制造出具有三维立体结构及生物功能的仿生组织或器官。目前,其研究、应用以及产业化的发展主要集中在生物3D打印装备和生物墨水的研发及制造、高端医疗器械的制造、复杂组织工程支架制造、体外生物功能结构体的制造以及药物病理模型研究等方面。

二、 生物3D打印技术的重要性及必要性

生物3D打印是3D打印技术中最前沿和最富生命力的研究领域,也是最具活力和发展前景的方向。目前,其在生物医学领域的广泛应用主要体现在3个层次:一是制造体外无生物相容性的材料,应用于3D打印医疗模型以及手术导板、定制式矫形器械等;二是制造有生物相容性的体内植入物(包括可降解及不可降解2种类型的材料),如金属打印的下颌骨移植物等个体化永久植入物,以及可降解、仿生、诱导组织再生的组织工程支架等;三是构建含活细胞的仿生三维组织,现已实现的在动物体内移植的皮肤[5]、卵巢[6]、膀胱[7]和心脏[8]等器官和组织,植入体内后依旧保持良好的生物相容性。随着生物3D打印实现从“非活体”打印到“活体”打印的转变,将进一步推动医疗行业个性化、精准化、仿生化的跨越式发展,对提高国民健康水平具有重大意义。
组织器官短缺是世界性重大难题,然而,由于人体环境极其复杂和精细,传统的组织工程技术难以实现对细胞在空间位置上分布排列的精准控制、细胞与生物材料的有机结合以及组织微环境的精准模拟。与传统制造技术相比,生物3D打印技术能够精确控制细胞、生物材料以及生长因子的空间分布,解决多细胞、多材料的高精度、高仿生打印,有望满足对精细细胞组装方式、组织微环境的精准模拟以及细胞-材料集成后的功能保持等复杂要求,为实现组织和器官的重建提供了必要的物质手段和工具。

三、 生物3D打印在颅颌面领域的研究及应用

生物3D打印技术具有高精度、个性化定制以及对复杂结构的精准成型能力等独特优势,为临床上人体组织器官重建的迫切需求带来新思路,有望满足当代精准修复与个性化治疗的迫切需求。近几年,借助生物3D打印模拟人体组织生长所需的三维环境与添加诱导分化功能的生长因子,培养出了简单的骨组织(颅骨[9]、下颌骨、软骨)、神经脊髓[10]以及血管等类似于人体正常组织、器官的替代物,为再生医学的发展奠定了基础。

(一)生物3D打印技术用于颅颌面骨修复
现有的人工颅颌面骨修补材料主要是以钛网和聚醚醚酮材料为主,基于3D个性化制造的植入物植入体内后,具有良好的生物相容性、与缺损部位形状精准匹配等优势,在临床上得到广泛应用。但是钛金属和聚醚醚酮材料都不具有降解特性,无法满足骨再生需求,尤其对于有骨生长需求的小儿患者治疗效果欠佳。2015年,Atala团队通过CT扫描、组织和器官集成打印技术(integrated tissue-organ printer,ITOP),利用聚己内酯材料和负载软骨细胞的水凝胶进行打印,并在支架中设计了微通道结构,制备出尺寸为3.2 cm × 1.6 cm × 0.9 cm的外耳模型,体外培养5周后观察到新生软骨形成,新形成组织中的细胞表现出与宿主耳软骨中相似的形态特征,细胞位于典型的软骨细胞陷窝内,被软骨基质包围。植入小鼠背部皮下2个月后观察,实验小鼠身体上的外耳依旧保持原有结构,有大量新生软骨形成,且已经形成软骨组织和血管系统。这一实验结果表明,通过融入微通道的设计,能够为细胞提供所需的营养物质,以及支持细胞和组织的生长,为打印组织中血管、神经系统的形成提供了可能[9]。针对颅骨缺损修复中植入物的形状、骨再生需求、生物材料来源和细胞来源等问题,笔者徐弢团队与西京医院费舟等基于生物3D打印技术结合自体颅骨瓣来源的骨基质颗粒和自体骨髓间充质干细胞,制备出多元个性化的再生型自体颅骨植入物,其具有良好的生物相容性、生物安全性以及成骨、促矿化和促骨成熟能力,为骨缺损替代修复的临床治疗提出了一种新的思路,实现真正的患者特异性,为颅骨缺损替代的再生修复提供了可行性[11](图1)。

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虽然这种个性化自体骨具备了患者特异性颅骨再生修复材料的基本特性,但若要满足实际临床应用,未来仍需在生物材料使用、打印体系改进和自体骨基质活性保留方面进一步完善。

(二)生物3D打印用于神经再生修复
随着再生医学的不断进步,对支架优化、细胞植入以及生长因子的引入等方式,在神经组织修复中已经被大量研究和应用。Koffler等[10]基于生物3D打印技术模拟中枢神经系统结构支架,制备了具有白质和灰质结构的聚乙二醇/甲基丙烯酸酯化明胶(polyethylene glycol-methacrylated gelatin, PEG-GelMa)仿生脊髓支架,将负载神经干细胞的支架移植到脊髓严重受损的大鼠体内,植入4周后,新的脊髓组织在受伤位置再生,并可与分离的脊髓端连接起来,该植入的支架中包含数十个微小的、宽度为200 μm的通道,可以引导神经干细胞和轴突沿着脊髓损伤的路径生长;另外,接受治疗的大鼠后腿功能性运动得到显著改善。笔者徐弢团队基于同轴打印平台,以同轴挤出打印方式制备了具有核-壳结构的负载施旺细胞(Schwann’s cells, SC)/神经干细胞(neural stem cells,NSC)的海藻酸钠水凝胶纤维,仿生模拟体内神经纤维的结构(图2);研究表明在藻酸盐壳中神经因子的基因表达明显增多。同轴生物3D打印构建的SCs/NSCs共培养体系中,培养过程中通过外层的SCs持续不断地分泌神经营养因子,内壳的NSCs增殖和分化趋势增强,这对于神经再生修复具有较强的应用潜力[12]。

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(三)生物3D打印用于血管化研究
人体正常组织或器官的血管系统是由各级分支构成的网络结构,直径尺寸从毫米级的大血管到微米级的毛细血管。因此,在人造组织或器官中构建多尺度的灌注血管网络至关重要。目前,生物3D打印血管的模式主要有间接打印和直接打印2种。间接打印的血管化主要是基于牺牲材料溶解后产生中空管道系统来实现,但是需要一个复杂的二次成型过程[13]。Kolesky等[14]打印了Pluronic F127 材料和含细胞的甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin, GelMa),通过降低温度Pluronic F127发生融化形成预留血管的通道位置,随后灌注人脐静脉内皮细胞完成血管化组织结构的构建。直接打印的方式如同轴生物打印,具有直接构建多尺寸流道的可行性和灌注培养的能力,在血管化领域有着广阔的应用前景。2017年,Byambaa等[15]采用了同轴生物3D打印方法来制造血管样结构,并且开发了一种新型的仿生材料用于配合同轴生物打印。该方法使用一种同心圆轴的针头来制造血管样结构, 选用GelMa作为打印墨水,通过调节外轴与内轴的流体速度来挤出合适的血管样结构;通过设定好打印参数可以实现大批量的血管制造,这种血管的管径和管壁厚度由挤出针头的直径决定。但是这种打印方式的精度一般在100~200 μm,难以实现更细血管的打印成型。国内赵昕和贺健康团队提出利用脱细胞的叶脉网络作为模板,经过一系列图像处理方法,基于光刻微制造技术获得具有仿生微流道的“叶脉芯片”,实现多级别、多尺度血管网络系统的可控制造,进一步在多级管道中种植血管内皮细胞,用于血管化功能器官的培养[16]。目前,生物3D打印在构建有弹性和高度血管化的复杂组织,以及在打印精度、生物墨水类型和打印后组织的生物学性能等方面依旧面临挑战。笔者徐弢团队基于生物3D打印制造出具有不同孔隙结构的可降解血管仿生支架(图3,表1)。

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四、 生物3D打印技术的新进展及思考

支架作为细胞的载体,其刚度、孔径、孔隙率等因素会显著影响细胞的黏附、增殖和分化特性。近年来,利用结合静电纺丝和3D打印分层制造原理的近场直写打印技术也成为研究热点,高度取向和有序排列的超细纤维阵列堆叠,实现亚微米、纳米尺度分辨率复杂三维微纳结构的制造。2020年,Wang等[17]以聚己内酯为原材料,基于微纳打印技术实现复杂三维神经网络构建,制备出纤维直径可控、排列取向有序的超细纤维支架,其中,纤维丝直径分布为15~150 μm,层-层纤维丝交叉堆叠角度分别为45°、60°、75°、90°;并对支架进行石墨烯涂层制备导电支架,在电刺激作用下评估神经轴突生长情况,该研究表明近场直写打印技术实现了超细纤维在大小及三维空间上的组织仿生,为构建接近人体复杂程度的神经网络组织奠定基础。生物3D打印可实现具有宏观大尺寸以及微纳尺寸的非均质体结构上的梯度构建,宏观尺度满足结构支撑,微纳尺度满足细胞生长,更加精准地模拟组织生长微环境。笔者徐弢团队基于近场直写3D打印技术制备了超细纤维支架,扫描电镜下可观察到支架的微观形貌:纤维丝直径在 1 μm 左右,且呈现层-层有序的直角交错堆叠;3D打印的中空管状支架纤维丝呈现有序的线性排列,纤维丝直径10 μm,间距100 μm(图4)。

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目前,生物3D打印的支架、含细胞植入物等大多是在体外打印成型后定向植入体内,为满足临床上倡导微创、精准治疗等需求,生物3D打印由体外打印更进一步发展到无创化、原位打 印等形式的体内制造。2020年国内研究首次报道了无创的体内3D生物打印技术,研究团队采用数字化近红外光聚合(digital near-infrared photopolymerization, DNP)打印技术,将生物打印的原材料(纳米光引发剂、单体和组织细胞)注射到皮下组织,通过在体外对近红外光进行调制并照射到目标位置,以诱导单体溶液的空间聚合实现原位成型[18]。在进一步的实验中,研究人员基于DNP在小鼠皮下无创打印了包含软骨细胞的耳廓形结构,1个月后支架仍保持良好的外观结构,且能观察到软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。笔者徐弢团队开发出一种可以安装到内镜上的微型生物打印平台,该打印平台具有Delta机器人,结合微机电系统实现微型化,具有降低体内侵入性、体积小、响应速度快的优点。打印平台通过内镜进入人体,并在到达损伤部位后进行组织修复,实现体内的原位打印。为模拟胃的解剖结构,以人胃上皮细胞和人胃平滑肌细胞作为生物墨水,在胃模型中打印出分层的组织支架(图5)。后续细胞培养结果表明,打印后的细胞在组织支架中保持较高的存活率和稳定的增殖能力,具有良好的生物学功能[19]。

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综上所述,生物3D打印技术的发展促进组织器官损伤修复朝着功能化、精细化和体内制造等方向发展。尽管生物3D打印技术发展迅速,现有的研究也证明了在打印类组织、器官支架有一定的可行性,但是依然存在一些关键问题需要攻克,如兼具生物相容性和生物力学特性的生物墨水开发、细胞体外扩增及打印后结构的功能性、材料与细胞之间跨尺度的集成与生物学性能适配、大块组织或器官的血管化系统构建、复杂组织打印及应用等仍面临挑战,未来需要进一步深入研究。

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